Bibliothèque codée par l'ADN (DEL) utilisent généralement l'affinity pulldown pour enrichir les composés qui lient les cibles d'intérêt. Bien qu'elle soit très efficace pour identifier des résultats positifs pour de nombreuses cibles, la technique du pulldown d'affinité a aussi ses limites. Par exemple, les cibles protéiques capturées sur une matrice en phase solide peuvent perdre leur structure native et leur activité. Les sites de liaison souhaitables sur la cible peuvent également être masqués et des sites de liaison non naturels dépendant de la matrice peuvent être créés, ce qui pourrait permettre d'enrichir des composés qui ne sont pas pertinents d'un point de vue physiologique. En outre, un lavage rigoureux est souvent nécessaire pour obtenir le rapport signal/bruit souhaité, et les effets secondaires malheureux de ce processus pourraient être le biais des résultats de la sélection vers des liants plus lents et une relation confuse entre l'enrichissement et l'affinité.

Récemment, le laboratoire Krusemark de l'université de Purdue a présenté une nouvelle approche de sélection de l'étiquetage de proximité en solution.¹ Au lieu de marquer la protéine cible par affinité, les auteurs se sont inspirés de la littérature sur la cartographie des interactions protéine-protéine (PPI) et ont marqué la cible avec l'ultraID, une petite enzyme qui produit de la biotine-AMP, une espèce réactive à courte durée de vie.² Lorsque la biotine-AMP diffuse à partir du site actif de l'ultraID, elle a une durée de vie limitée pour biotinyler un nucléophile avant d'être éteinte par l'eau, ce qui conduit à une “distance de marquage” limitée d'environ 10 nm. Ce comportement de marquage sélectif à proximité immédiate fournit un mécanisme permettant aux membres de DEL liés à la cible d'être biotinylés de préférence. Cela permet ensuite de les enrichir lors d'une étape ultérieure par capture de streptavidine. Il est important de noter que l'enregistrement de la liaison ligand-cible se fait en solution, ce qui élimine la nécessité de capturer la cible sur une matrice.

En utilisant des composés liés à l'ADN simple brin, chacun étant hybridé à un brin de complément fonctionnalisé par une amine (qui sert de nucléophile pour la biotinylation), les auteurs ont démontré un enrichissement de 6 300 fois d'un ligand de 50 nM sur le chromodomaine CBX7 marqué par ultraID, par rapport à un non-ligand. Fait crucial, le composé lié à l'ADN pouvait être :

• Récupéré par séparation des brins
• Hybridé à un brin frais fonctionnalisé à l'amine
• Sélection supplémentaire pour obtenir un enrichissement global de 500 000 fois (2 cycles)

Dans un scénario qui pourrait être plus pertinent pour l'identification de novo des résultats, un liant plus faible (K_d ≈ 2 µM au chromodomaine CBX7) a démontré un enrichissement de 400 fois en un tour et de 11 000 fois en deux tours. Dans une autre application de leur technologie, les auteurs ont effectué une sélection contre des récepteurs opioïdes δ marqués par ultraID à la surface de cellules vivantes et ont obtenu un enrichissement de 280 fois pour un ligand subnanomolaire, ainsi qu'un enrichissement de 40 fois pour un ligand de ~10 nM.

Outre l'ultraID, les auteurs ont mis au point un second système d'enrichissement dépendant de la proximité, basé sur la capacité de Nluc (une petite enzyme luciférase) à démasquer la biotine protégée par la coumarine dans un rayon limité (par transfert d'énergie de résonance de la bioluminescence, ou BRET). Bien que l'enrichissement de ligand à non-ligand (270 fois avec le chromodomaine CBX7) ait été moins impressionnant en raison d'une réactivité de fond plus élevée, le développement de cette méthode orthogonale pourrait offrir des possibilités de multiplexage avec l'approche ultraID.

Dans l'ensemble, ce nouvel article a introduit deux nouveautés dans le répertoire de sélection des DEL en solution. Ces méthodes consistaient auparavant en une PCR dépendante de l'interaction et en un enrichissement par piège de liaison, qui reposaient tous deux sur l'étiquetage de la protéine cible avec un oligonucléotide. Nous sommes impatients de voir ces nouvelles méthodes utilisées sur une bibliothèque chimiquement diversifiée pour enrichir de nouveaux engageurs de cibles de grande valeur. Vous pouvez parier que X-Chem surveillera de près cet espace !

Références

1. Cai, B. et al. Méthodes de sélection pour l'enrichissement dépendant de la proximité de ligands à partir de bibliothèques codées en ADN utilisant des protéines de fusion enzymatiques. Chem. Sci. 2023,14, 245-250.
2. Kubitz, L. et al. Ingénierie de l'ultraID, une enzyme compacte et hyperactive pour la biotinylation dépendante de la proximité dans les cellules vivantes. Commun Biol. 2022, 5, 657.